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超分辨光學成像

作者:     發布時間:2018年10月24日     閱讀次數:777

分辨光學成像特指分辨率打破了光學顯微鏡分辨率極限(200nm)的顯微鏡,技術原理主要有受激發射損耗顯微鏡技術和光激活定位顯微鏡技術。

管中亦可窺豹——受激發射損耗顯微鏡

     傳統光學顯微鏡采用寬場成像的方式,照明光一次照亮整個成像范圍,然后用相機對整個成像范圍進行曝光成像,一次獲得整幅圖像。“管中窺豹”型的掃描成像則有所不同,照明光聚焦在樣品上,形成一個極小的光點——也就是所謂的“管”,每次只對光點對應的區域進行成像;當我們改變光點的位置,使它依次掃遍整個樣品,也就獲得了一幅完整的圖像。有人要問了,即使采用“管中窺豹”的方式,每次聚焦的光點依然受到衍射極限限制,系統分辨能力比起所謂的寬場成像沒有提高,掃描過程又增加了系統的復雜度,不是自找麻煩嗎?Stefan W. Hell的回答很簡單:只要設法縮小“管中窺豹”的“管”,就能提高系統的分辨能力,實現超分辨。

     通常的熒光成像是這樣的:熒光分子在吸收了照明光(或者叫激發光)A之后,會在很短的時間持續發出熒光B。掃描成像系統的分辨能力取決于A在樣品處的聚焦光點大小。Hell找到了熒光的開關——第三種光C,在C的照射下,熒光分子即使吸收了激發光A,也沒法再發出熒光BHell讓開關C同樣打在樣品上,形成一個四周亮、中心暗的“面包圈”,“面包圈”中心的暗區域比艾里斑還要小;然后把面包圈套在艾里斑上,就像在“管”的出口又加了一個小孔,使“管”的直徑大大減少,也就提高了整臺顯微鏡的分辨能力。

 

“面包圈”限制了激發光A的有效范圍

“我只看到星星”,“我看到了銀河”——光激活定位顯微

  熒光分子是熒光樣品的最小發光單元,由于衍射極限的限制,在相鄰的兩個熒光分子同時點亮時,我們只能看到一個光斑,但如果每次只點亮一個分子,就可以通過光斑,計算得到熒光分子的準確位置。

Eric BetzigWilliam E. Moerner采用的就是這樣一種方法,如果說STED技術核心是“擦除”,那么PALM技術的核心就是“定位”:Moerner發現存在光D可以“打開”熒光。通過控制D的照射劑量,保證每次只有少量熒光分子處在打開狀態;當熒光分子在開與關之間切換時,整幅圖像中的熒光信號就會像銀河中的星星一樣亮暗閃爍,只要進行足夠多次的開關和成像,就可以組合出整個樣品的圖像。


溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結果。(左)傳統光學顯微鏡成像;(中)光激活定位顯微鏡成像;(右)放大的光激活定位顯微鏡成像。


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